Описание

Вариант 1

1. Дайте определение термину «Каллус».

2. Приведите преимущества получения биологически активных веществ из культуры ткани растительных клеток по сравнению с традиционным методом.

3. Какие питательные среды применяются для культивирования растительных клеток?

4. Этапы получения культуры ткани раувольфии змеиной (условия, оборудование).

5. Охарактеризуйте химические вакцины: антиген, вспомогательные вещества, тип и длительность иммунитета, способ введения вакцины, заболевания.

6. Приведите этапы получения живой бактериальной и вирусной вакцины.

7. Приведите номенклатуру препаратов анатоксинов (название, лекарственная форма, показания для применения).

8. Дайте определение термина «Иммуноглобулины».

9. Что такое кровь и какие у неё функции?

10. Напишите этапы получения альбумина: условия, оборудование.

11. Приведите классификацию бактериофагов по завершенности жизненного цикла.

12. Составьте схему получения жидкого стрептококкового бактериофага во флаконе.

13. Приведите классификацию антибиотиков по химическому строению с примерами.

14. Какие особенности состава питательных сред при получении антибиотиков Вы знаете? (источники углерода, источники азота, минеральные компоненты, предшественники).

15. Составьте этапы получения эргокальциферола биотехнологическим методом (продуцент, условия, оборудование).

16. Дайте определение термина «Витамины».

17. Приведите этапы получения гидрокортизона биотехнологическим методом (трансформирующая культура, условия, предшественники).

Ответ:

1. Дайте определение термину «Каллус».

1. Новообразование из паренхимных недифференцированных клеток на раневых поверхностях растения. Возникает в виде валика или аморфной массы в местах надрезов, трещин на концах черенков, в культуре клеток и тканей. Особенно энергично образуется Каллус тогда, когда в раневой зоне есть камбий. Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок, образованию корней при вегетативном размножении растений. Может возникать на любом органе семенных растений; у споровых образуется редко. 2. Уплотнение, покрывающее утонченное место оболочек в базальной части спор у некоторых высших Basidiomycetes.

2. Приведите преимущества получения биологически активных веществ из культуры ткани растительных клеток по сравнению с традиционным методом.

Преимуществами клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем, выращиваемым на плантациях являются:

1. получение экологически чистых растительных продуктов независимо от климата, сезона, погоды, почвенных условий;

2. высокие скорости получения биомассы при оптимизации условий выращивания;

3. более высокое по сравнению с интактным растением содержание нужного продукта в биомассе при использовании штамма-сверхпродуцента;

4. возможность полной автоматизации процесса;

5. сохранение пула генов редких и исчезающих растений-продуцентов метаболитов для промышленности.

3. Какие питательные среды применяются для культивирования растительных клеток?

Питательные среды — это многокомпонентные жидкости или плотные гели, созданные специально для выращивания клеток разного типа. В их состав входят различные аминокислоты, соли, витамины, гормоны, факторы прикрепления и роста, смешанные в определённых пропорциях. Среда должна содержать все необходимые питательные компоненты в легкоусвояемой форме, быть изотонической, сбалансированной с высокой буферной ёмкостью.

Успех в культивировании объектов зависит от правильного выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы (N, P, K, Ca, S, Mg, Fe, B, Zn, Cu, Co, Mn, J, Mo); витамины В₁, В₆, В₁₂, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей.

На средах без гормонов растут “привыкшие” и опухолевые ткани.
Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов.
Из ауксинов чаще всего применяют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) — 0.1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) — 0.1-2 мг/л, ИУК — 1-30 мг/л.

Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов.

В качестве цитокининов используют кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП), зеатин (0.001-10 мг/л); из них кинетин наименее активен. В состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК). В качестве ростактиваторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др.

Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания:

— среда без глюкозы — для хлореллы, цианобактерий;

— среда без витаминов и гормонов — для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna);

— среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами — для культивирования клеток и тканей высших растений.

Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Составы питательных сред, получивших наибольшее распространение приведены в справочниках по физиологии растений и биотехнологии.

4. Этапы получения культуры ткани раувольфии змеиной (условия, оборудование).

Одной из задач биотехнологии является получение лекарственных препаратов из культуры ткани растений. Применение с этой целью культур растительных клеток и тканей отличается рядом преимуществ по сравнению с использованием плантационного и дикорастущего сырья: возможность круглогодичного выращивания биомассы, независимость от климатических и географических факторов, стандартность и более высокое качество сырья.

Тропическое растение из семейства кутровых (Apocynaceae) раувольфия змеиная Rauwolfia serpentina Benth. является источником многих индольных алкалоидов, широко применяемых в медицинской практике в качестве гипотензивных, противоаритмических и седативных лекарственных средств. Центральное место в ряду алкалоидов этого растения занимает аймалин. Аймалин — антиаритмический препарат, эффективное лекарственное средство при лечении сердечно-сосудистой системы. Поскольку раувольфия змеиная является эндемическим видом, находящимся под угрозой уничтожения, и отличается медленным темпом роста и относительно низким содержанием аймалиновых алкалоидов, в настоящее время эти соединения получают из культивируемых in vitro тканей этого растения.

Содержание раувольфии змеиной корней суммы алкалоидов в пересчете на сухую субстанцию должно быть не менее 90,0 %.

Содержание резерпиноподобных алколоидов в пересчете на резерпин должно быть от 14,0 % до 16,0 % в пересчете на сухое вещество.

Описание. Порошок от коричневато-желтого до красновато-коричневатого цвета. Без запаха.

Растворимость. Растворим в спирте 96 %, хлороформе, практически нерастворим в воде.

Подлинность.

1. Тонкослойная хроматография

Приготовление растворов.

Раствор стандартного образца (СО) резерпина. 0,02 г СО резерпина помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 7 мл хлороформа, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор используют свежеприготовленным.

Раствор стандартного образца (СО) аймалина. 0,02 г СО аймалина помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 7 мл хлороформа, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор используют свежеприготовленным.

Раствор азотной кислоты. 5 мл азотной кислоты концентрированной помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Раствор используют свежеприготовленным.

Около 0,04 г субстанции помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 25 мл хлороформа и перешивают на магнитной мешалке при скорости вращения 600 об/мин в течение 10 мин. Полученные хлороформные извлечения помещают в круглодонную колбу, фильтруют через бумажный фильтр, содержащий 1 г натрия сульфата безводного, промывают 5 мл хлороформа и выпаривают под вакуумом на водяной бане при температуре не выше 40-45 °С досуха. Сухой остаток растворяют в 3 мл хлороформа (испытуемый раствор).

На линию старта хроматографической пластинки со слоем силикагеля наносят по 5 мкл испытуемого раствора, раствора СО резерпина и раствора СО аймалина. Пластинку с нанесенными пробами сушат при комнатной температуре в течение 5 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение не менее 1 ч смесью растворителей гексан — ацетон — диэтиламин (7:2:1) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105 ºС в течение 10 мин.

Пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты.

На хроматограмме растворов СО резерпина и СО аймалина должны обнаруживаться зона адсорбции белого цвета (резерпин) и над ней зона адсорбции розового цвета (аймалин).

На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться зона адсорбции белого цвета на уровне зоны СО резерпина и над ней зона адсорбции розового цвета на уровне зоны адсорбции СО аймалин; допускается обнаружение других зон адсорбции.

Качественная реакция

а) 0,01 г субстанции смачивают в выпарительной чашке 0,15 мл азотной кислоты концентрированной; должно наблюдаться окрашивание от красного до фиолетово-красного цвета (алкалоиды группы аймалина).

б) 0,01 г субстанции смачивают в выпарительной чашке 0,3 мл раствором ванилина в хлористоводородной кислоте, прибавляют 0,15 мл серной кислоты концентрированной; должно наблюдаться окрашивание от красного до фиолетово-красного цвета (алкалоиды группы резерпина).

Потеря в массе при высушивании. Не более 9,0 %. В соответствии с тре­бованиями ОФС «Потеря в массе при высушивании» (способ 1 из навески субстанции 1 г, высушивают в течение 5 ч).

Сульфатная зола. Не более 0,25 %. В соответствии с тре­бованиями ОФС «Сульфатная зола».

Тяжелые металлы. Не более 0,001 %. В соответствии с тре­бованиями ОФС «Тяжелые металлы».

Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».

Микробиологическая чистота. В соответствии с тре­бованиями ОФС «Микробиологическая чистота».

Количественное определение.

2. Сумма алкалоидов

Около 0,5 г (точная навеска) субстанции растворяют в 20 мл смеси: хлороформ – спирт 96 % (3:1) в делительной воронке вместимостью 200 мл. Экстрагирование повторяют дважды в описанных выше условиях, каждый раз фильтруя извлечения через тот же бумажный фильтр в ту же делительную воронку. К объединенным хлороформным извлечениям в делительную воронку прибавляют 150 мл эфира, перемешивают. Полученную смесь обрабатывают серной кислоты раствором 0,5 М пятикратно порциями по 20, 15, 15, 10 и 10 мл, каждый раз перемешивая в течение 3 мин. Сернокислотные извлечения последовательно собирают в делительную воронку вместимостью 250 мл, подщелачивают аммиака раствором концентрированным 10 % до рН около 10 (по универсальной индикаторной бумаге).

Объединенное хлороформные извлечения фильтруют через бумажный фильтр, содержащий 4 г натрия сульфата безводного, в круглодонную колбу. Делительную воронку и фильтр промывают 10 мл хлороформа, который присоединяют к основному фильтрату. Фильтрат выпаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40-45 °С досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл спирта 96 %, раствор количественно переносят в предварительно взвешенный бюкс и снова отгоняют растворитель на роторном испарителе при температуре не выше 40-45 °С досуха. Колбу с сухим остатком сушат при  температуре не выше 100-105 °С до постоянной массы, охлаждают в течение 30 мин  эксикаторе и взвешивают.

Содержание суммы алкалоидов в пересчете на абсолютно сухую субстанцию в процентах (Х) вычисляют по формуле:…

где    а_о – масса сухого остатка в колбе, г;

а – навеска субстанции, г;

W– потеря в массе при высушивании, %, г.

2. Резерпиноподобные алкалоиды

Приготовление растворов.

Раствор стандартного образца (СО) резерпина. 0,03 г СО резерпина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в спирте 96 %, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 5,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл помещают, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и  перемешивают.

Растворы используют свежеприготовленными.

Лимонной кислоты раствора 2 %. 2 г лимонной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок годности раствора не более 1 сут при хранении в прохладном месте.

Натрия гидрокарбоната раствор 1 %. 1 г натрия гидрокарбоната помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

Раствор используют свежеприготовленным.

Серной кислоты раствора 0,25 М. 50 мл 0,5 М раствора серной ктслоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок годности раствора не более 6 мес при хранении в прохладном месте.

Сульфаминовой кислоты раствор 5 %. 5 г кислоты сульфаминовой растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Все операции должны проводиться в непрерывном режиме в защищенном от света месте.

Около 0,01 г (точная навеска) субстанции количественно переносят при помощи 10 мл  лимонной кислоты раствора 2 % и 15 мл хлороформа в делительную воронку вместимостью 100 мл и энергично взбалтывают в течение 2 мин. Хлороформный слой отделяют в другую делительную воронку, экстракцию повторяют 2 раза по 15 мл хлороформа в тех же условиях. Объединенные хлороформные извлечения помещают в делительную воронку и промывают 10 мл натрия гидрокарбоната раствора 1 %, взбалтывают в течение 2 мин и фильтруют через бумажный фильтр, содержащий 1 г натрия сульфата безводного, в мерную колбу вместимостью 50 мл. Делительную воронку ополаскивают хлороформом 2 раза по 2 мл,  фильтруют в ту же мерную колбу и доводят объем раствора  хлороформом до метки и перемешивают…

32 стр.

В целях сохранения высокой уникальности текста фрагмент работы выложен частично.

После оплаты Вам откроется доступ к полному ответу.